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PCR 反应五要素
人阅读 发布时间：2019-12-04 09:49
杏园生物 PCR 引物系列小贴士之 PCR 反应五要素
PCR 反应五要素：参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30 bp，常用为 20 bp 左右。
②引物扩增跨度： 以 200-500 bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10 kb 的片段。
③引物碱基：G+C 含量以 40-60% 为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度 0.1～1 μmol 或 10～100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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酶及其浓度：目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5 U（指总反应体积为 100 μl 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris.HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5，小量分装， -20 ℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200 μmol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等（ 等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+ 结合，使游离的 Mg2+ 浓度降低。
模板（靶基因）核酸：模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与 lv 仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或 y 丙醇沉淀核酸。医学教育 | 网搜集整理提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。
Mg2+ 浓度：Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200 μmol/L 时，Mg2+ 浓度为 1.5～2.0 mmol/L 为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。
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