Real-time  PCR 现已成为一种成熟的 mRNA 定量手段，Taqman 探针和 Sybr-Green 法是常用的两种方法。其中，Sybr-Green 法因为使用方便、价格相对低廉而被广泛使用，但是这种方法对引物的要求更高，因此，引物的设计是成功进行 Sybr-Green 法 Real-time  PCR 检测的关键。很多科研人员，尤其是做临床的，做 PCR 实验只是一时的需要，并没有花时间去深入研究引物设计本身。

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选择 qPCR 引物时，该注意的问题有哪些呢？

1.  引物特异性
很多人以为引物特异性就是指的扩增产物单一，其实转录组相似序列的干扰也常常是造成检测假阳性的主要原因，尤其是在目标转录本表达水平较低而相似序列表达量高的情形下。对于扩增产物单一性的检测，我们需要查看熔解曲线是否单一，还要看 PCR 产物电泳图是否单一。如果需要保证高度单一，杏园生物还可以采用 Labchip 进行产物分析（可以区分 4bp 大小的片段）

2. 可变剪切
但是除此之外，我们还要特别注意还包括著名的可变剪切。RNA 的可变剪切可以导致产生不同的转录本，并导致翻译编码形成多种蛋白，可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。据估计人类基因组出现可变剪切的几率高达 60%。当需要检测某个特定剪接体的转录水平时，引物设计需使得扩增子限定在区别于其他剪接体的区段。否则检测到的转录水平是所有剪接体的总和而不是特定剪接体。

3. 扩增效率
如果要用 ΔΔCT 方法进行最后的计算，就需要目的基因和内参基因有相近的扩增效率。较好的引物扩增效率应该在 90%-110%，且线性回归系数 R² 大于 0.98。

4. 引物生产工艺
引物在生产的过程中一般都会有大约 0.01% 的错误可能（根据不同生产商，会略有差异）。除此之外，还有副产物（脱盐纯化）以及大量盐分（尤其是 page 纯化），这并不一定影响 PCR 实验，但是也可能会导致实验不稳定。一般在临床试剂中使用的引物和探针都会尽量避免这个问题，而绝大多数科研引物都常常忽略这个问题。杏园生物的引物生产工艺有较高的纯度和较低的盐分，能够更好得保证实验的稳定性。

5. 引物是否跨内含子
在核酸抽提的过程中，抽提的 RNA 往往还有少量的 DNA（根据不同的抽提试剂盒以及操作本身，比例不同），因此也会对实验结果产生影响。一般跨内含子的引物可以有效区分 RNA 和 DNA 样本。可以只检测 RNA 里的基因表达。

6. 引物设计在靠近 5' 端还是 3' 端
一般来说，受反转录效率和 mRNA 降解偏好性差异的影响，靠近 3' 端的引物能够更好得反映基因的表达情况。

杏园生物在 Real-time  PCR 引物设计及检测上积累了丰富的经验，并自主开发了引物设计软件，提供给您经过实验验证的引物产品，能够帮助您快速获得检测工具，从而方便快捷地检测到内源目的基因的表达情况。