1.血小板及其转录组简介

       血小板是没有细胞核的血细胞，其主要和关键功能是通过在血管破裂处形成血凝块来止血。然而细胞核的缺失并没有阻碍基因在血小板中的转录。研究证实，血小板拥有翻译所需的机制，并从信使RNA库中积极合成必需蛋白质，从而揭示血小板的 RNA 在血小板生理学中发挥作用，而不仅仅是前体 MKS 的一组非功能性残余物。此外，基因的调控表达可以在血小板中发生，血小板转录物也可以转移到其他细胞。因此，转录组可以作为血小板中的基因组替代品，并可以使血小板自主通过产生特定蛋白质对特定刺激做出动态反应。
                              
                                           图1.血小板如何获得 RNA。（A）主要的RNA库是从 MK 遗传来的。（B）RNA 转移有助于形成血小板转录组。

2.分离与测量

       血小板细胞含有约 2.2 飞克的总 RNA，比其较大的无核细胞谱系「表亲」红细胞多近 4 倍，但比有核细胞（如 T 细胞、B 细胞或粒细胞）少约 1000 倍。因此，少量的白细胞可能会引入显著的偏差，要获得血小板转录组的准确定量就需要从血液样本中存在的其他细胞中有效分离血小板。从全血种分离血小板最常用的方法是使用离心法。由于血小板可以由于强大的机械力和与其他细胞的相互作用而被激活，离心力也必须受到限制。此外，使用磁性微珠可以帮助进一步降低污染的风险，代价是可能损失大量的血小板。
      有几种测定方法可用于测量血小板的转录组。检测血小板转录物的早期是使用 Northern 印迹或 RT-PCR，虽然范围有限，但这些方法在研究大量个体的特定基因时仍然具有相关性和成本效益，特别是 RT-PCR 更经济更简单。然而，当涉及到在一次测定中表征数千个血小板转录物时，主要是通过生物芯片和 RNA 测序，后者虽然更昂贵，但它提供了最多的信息，具有全基因组覆盖和表达转录物的定量，包括非编码 RNA，基因异构体，以及检测序列读取中的变体。

3.血小板转录组特征

       血小板转录组 RNA 具有多样性，包括信使 RNA（成熟和前体 mRNA），miRNA，以及其他具有调节、结构或催化功能的非编码 RNA，如核糖体 RNA、环状 RNA、小核仁 RNA 或转移 RNA。RNA 的丰度通常遵循对数正态分布，大多数转录物具有低到适度的表达，而少量剩余的转录物达到较大丰度。然而，血小板中存在的所有 mRNA 可能都不是生理相关的。也有观察表明，在前血小板形成过程中发生了一些分选。有研究者比较了血小板和 MKS 的转录组，观察到两种细胞类型之间仅有中度相关。
     血小板转录组的一个显著特征可能是高丰富的线粒体转录物，占非小 RNA 的 60% 以上。考虑到其他细胞类型中的线粒体通常不表达 >15% 的细胞转录组，这是很重要的。这一结果与线粒体对血小板功能和存活的重要性一致，因为血小板活化和聚集可能需要代谢产物和细胞器提供的大量能量。因此，血小板是血流中线粒体的重要储库，并可在炎症和激活等条件下释放线粒体。重要的是，一些参与核糖体 RNA 耗竭的血小板 RNA 分离方案可能会改变血小板转录组，并耗竭丰富的线粒体核糖体 RNA，同时可能会增加对丰度较低的 RNA 的读取检测。
    血小板的另一个特殊性是存在前体 mRNA（pre-mRNA），即仍具有内含子的未剪接 mRNA。经研究发现，无论是由于遗传还是环境因素的变化导致血小板被激活后，观察到前体 mRNA 的信号依赖性剪接，并且激活后 mRNA 成熟是相对广泛的，并不局限于少数特定基因。
4.血小板转录组多变性

       虽然许多研究已经观察到高度的个体间相关性，但据报道，有几个因素可以进一步塑造和完善血小板转录组，包括人口统计学因素，如性别、年龄或祖先，以及血小板年龄、血小板活化、病理逻辑条件和遗传调节因子。
                                     
                                                                                                                  图2.血小板转录组多变性的来源

4.1.人口因素

       多项研究表明，不同年龄阶段的人的血小板转录组（包括 mRNAs 和 miRNAs）具有显著差异，特别是对于表达高的基因。祖先似乎也可以调节几个基因和 miRNA 的表达水平。例如，miR-376c–pCTP 网络在欧洲和非洲祖先个体之间差异表达。

4.2.血小板异质性

       单个血小板的转录组也不是静态的，在循环几天后会进化。此外，血小板可以根据大小、密度或体积等物理特征分类为不同的亚群，这些不同的血小板群在含量和能力上存在差异。
       较老的血小板可能具有更多样化的转录组，因为血小板可以通过几种机制与环境交换内容，包括颗粒释放、细胞外囊泡摄入或释放、病毒相互作用或血管内直接的细胞间相互作用。血小板转录组图谱的演变可能是由于核糖体清除后的 RNA 衰变。它们可能会让血小板吸收并保留血小板活性所需的转录物，或者丢弃和降解不必要的 RNA。

4.3.病理状态
 
       在患有各种疾病的个体中也观察到血小板转录组的改变，包括炎症、血栓形成、癌症、糖尿病或感染性疾病。重要的是，这些结果为临床医生提供了潜在的诊断工具，因为血小板丰富且易于通过血液采样获取。特别是对于癌症，已知肿瘤细胞与血小板相互作用，并将肿瘤相关因子（如转录物和蛋白质）转移到血小板中，从而改变血小板的转录组图谱。

4.4.基因调控因子

       一些血小板特征已被证明具有高度遗传性，如血小板计数、平均血小板体积或血小板反应性。
 
5.结论和展望

      对血小板转录组的开创性研究揭示了基因表达的高度个体间相关性，这意味着血小板转录组图谱相似、稳定，因此在个体之间具有可比性。从那时起，许多研究探索了健康和疾病中的血小板转录组，并报道了影响 RNA 表达的潜在因素，包括直接参与血小板功能的基因的表达。这一持续的努力导致了许多引人注目的发现，在本手稿中进行了大量综述，包括用于疾病诊断的潜在工具，以及用于生物、医学和输血研究的潜在工具。
     此外，多年来，RNA 测序的成本不断下降，使得越来越多的样本量更大的研究能够提供更完整的血小板转录组。值得注意的是，这允许对非编码转录物和基因异构体进行更精确的定量，揭示两者在血小板中大量存在，并且也与血小板功能相关。
       然而，血小板转录组的分析是具有挑战性的，因为潜在的污染需要严格的分离方案，并且相对于其他细胞类型，总 RNA 的量很少。考虑到其转录组的很大一部分被线粒体 RNA 占据，分离和纯化方案可能需要进一步调整。此外，鉴于血小板中转录物表达和蛋白表达之间的低相关性（Pearson s R<0.3），这种可变表达对血小板蛋白产生和血小板功能的影响仍有待在大规模人群研究或靶向机制研究中进行评估。实施基因的完全敲除或过表达的功能分析是确定所测表型相关性的有用方法，但在巨核细胞和血小板中进行这些分析可能具有挑战性，需要潜在的干细胞方案、血小板谱系特异性小鼠（PF4-Cre）或具有功能读数的核巨核细胞的潜在直接工程。然而，这样的实验并不一定解决巨核细胞和血小板中中等水平基因表达的影响。
       比较不同动物物种的血小板转录组也可能是有意义的，作为一种手段来评估血小板作用的保守性，以及它们在非哺乳动物中的有核血小板「表亲」在进化中的保守性。然而，迄今为止，很少有研究在除小鼠和人类以外的生物体中使用转录组测序，这表明跨物种比较和物种特异性表征仍有很大的机会。
     血小板转录组学领域必将受益于新兴的技术进步。长读测序和单细胞测序的应用将提供更完整、更准确和更好的血小板转录组分辨率，。但这些方案仍然面临着获得准确的转录物检测和定量的挑战。
参考文献：
Florian Thibord , Andrew D. Johnson，Sources of variability in the human platelet transcriptome，Thrombosis Research 231 (2023) 255–263

Tips：血小板分离试剂盒（超纯、防激活）助您更好地研究血小板转录组！