血小板(platelet，thrombocyte)是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质，巨核细胞虽在骨髓造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。血小板常成群分布在红细胞之间，循环血中正常状态的血小板呈两面微凹、椭圆形或圆盘形。人的血小板平均直径约2-4微米，厚0.5-1.5微米，平均体积约7立方微米。血小板无细胞核，但有细胞器，此外内部还有散在分布的颗粒成分。血小板在止血过程中发挥着重要作用，帮助形成血液凝块，同时也是多种生长因子，包括血小板源生长因子(platelet-derived growth factor)、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)、碱性纤维原细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，b FGF) 等的自然来源。人体内血小板数量和功能异常会产生血小板病，血小板过低或功能降低将导致出血 ，血小板过高则容易产生血块。

      目前，血小板因为分离提纯的具体流程不明确，限制了临床中对血小板的研究的开展。回顾既往分离提纯血小板的方法，存在污染率高、回收率低的缺陷。

      实验室研究中多采用梯度离心法、流式细胞仪结合抗体法和凝胶层析柱法。梯度离心法可快速获取高浓度血小板，但常伴随大量白细胞污染。流式细胞仪结合抗体法和凝胶层析柱法，可有效去除血小板中白细胞污染，获取纯化血小板，但此类方法步骤繁琐，花费庞大，需要配备特定的实验室仪器，且分选时间较长且容易造成血小板RNA降解。
      目前我国部分血液中心和医院输血科为了减少输血不良反应，已广泛应用一次性白细胞滤器过滤法。白细胞滤器主要依靠一层特定的滤膜来过滤白细胞，它的工作原理有以下两个方面，一是阻滞作用；二是白细胞的黏附特性。然而输血科所使用的白细胞滤器体积巨大，适用于每袋一百至数百毫升的血液，而不适合用于实验室微量血液的处理。

      针对现有技术中血小板研究存在的问题，本领域技术人员一直在寻找解决的方法。

      本发明的目的在于提供一种外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法， 以解决使用现有血小板研究中存在血小板分离纯度不高，仅适用于特定实验研究的问题。
在本发明所提供的外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法中，所述外周血血小板分离试剂盒包括白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。本发明设计的外周血血小板分离试剂盒将梯度离心法和滤膜过滤相结合，在分离获得高纯度血小板(纯度可达99 .98％)的同时，避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染，实现直接从人体全血样品中分离出结构完整且高纯度血小板。经本发明的外周血血小板分离试剂盒分离提纯的外周血血小板除可用于凝集试验、功能检测等传统研究外，还可用于实时定量PCR、高通量测序等灵敏度高的分子实验，具有普适性。
为了验证本发明的外周血血小板分离方法的可靠性，下面比较分析三种不同的血小板分离方法的优劣。

  三种血小板分离方法具体如下：
方法1：传统差速离心分离方法(两步离心法)。
方法2：采用外周血血小板分离试剂盒进行外周血血小板分离方法。
方法3：白细胞滤器+磁珠分选方法(第一次离心+白细胞滤器过滤+磁珠分选+第二次离心)。
最后利用流式细胞仪、荧光定量PCR检测污染白细胞、血小板回收率。

1 .1 利用流式细胞仪检测分离纯化所得的血小板中混杂的白细胞数量，CD45标记白细胞。
请参考图1.1，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD45标记白细胞后的示意图。如图3a所示，框线R1框选范围内的每个黑点代表一个白细胞，黑点的数目就是Counts数量，该数目越小，说明分离纯化的效果越好；黑色集中的区域显示的是密集的血小板。基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板中混杂的白细胞数量的比值结果为50：1。由此可知，基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少。

图1.1

1 .2 利用流式细胞仪检测血小板回收率，用CD61标记血小板。
请参考图3b，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3b所示，基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板回收率的比值结果为1：4。由此可知，基于方法2所得的血小板量较较方法1高。每一个上样量(5/10万毫升外周血中) ，分离可得约40000个血小板，即每毫升外周血均可获得2×108个血小板。

图1.2

1 .3 利用流式细胞仪检测血小板回收率，用CD61标记血小板。
请参考图3c，其为利用流式细胞仪检测基于方法2和方法3获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3c所示，基于方法3和方法2分离纯化所得的血小板回收率的比值结果为1：15。由此可知，基于方法2所得的血小板量较方法3高。

图1.3

1 .4 利用流式细胞仪检测分离纯化所得血小板中混杂的白细胞数量，用CD61标记血小板，CD45标记白细胞。
请参考图3d，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD61标记血小板，CD45标记白细胞后的示意图。如图3d所示，比较方法1和方法2的分离结果可知，基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少。

图1.4

1 .5 利用流式细胞仪检测不同处理方法过程中血小板的活化情况。用CD61标记血小板，CD62P标记活化血小板。
请参考图3e，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2过程中血小板的活化情况，用CD61标记血小板，CD62P标记活化血小板后的示意图。如图3e所示，比较方法1和方法2的分离结果可知，基于方法2过程中的活化血小板较少，基于方法1过程中的活化的血小板较多。

图1.5

1 .6 利用荧光定量PCR检测分离纯化所得血小板中混杂的白细胞数量，用ANPEP标记白细胞。请参考图3f，其为以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用ANPEP标记白细胞后的示意图。如图3f所示，比较方法1 和方法2的结果，可知基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少，离纯度高(99 .98％)。
 
图1.6

1 .7 利用荧光定量PCR检测血小板回收率，用CD61标记血小板。请参考图3g，其为以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3g所示，基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板回收率结果可知，基于方法2所得的血小板量较方法1高。

图1.7

       综上三种血小板分离方法对比分析可知，基于本发明的外周血血小板分离试剂盒进行血小板分离所得的血小板含量较高，白细胞的残留污染较少，每毫升外周血平均可获得2×108个血小板，分离纯度高(99 .98％)。优于其他分离方法。

       对于实施例公开的方法而言，由于与实施例公开的结构相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见结构部分说明即可。
综上，在本发明所提供的外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法中， 所述外周血血小板分离试剂盒包括白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。本发明设计的外周血血小板分离试剂盒将梯度离心法和滤膜过滤相结合，在分离获得高纯度血小板(纯度可达99 .98％)的同时，避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染，实现直接从人体全血样品中分离出结构完整且高纯度血小板。经本发明的外周血血小板分离试剂盒分离提纯的外周血血小板除可用于凝集试验、功能检测等传统研究外，还可用于实时定量PCR、高通量测序等灵敏度高的分子实验， 具有普适性。
上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。