如何用qPCR法检测支原体污染

821 人阅读发布时间：2023-05-06 09:29

实验方法原理

PCR法的基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA链扩增延伸。

优势

可用于快速高通量检测；
细胞培养物和细胞培养上清等液体无需提取DNA，可以直接检测；
灵敏度度高，特异性好，更精准。

实验材料

液体样本

试剂盒

MycoSybr™ Mycoplasma qPCR Detection Kit
(MycoSybr™ 支原体qPCR检测试剂盒根据《欧洲药典》第2.6.7章描述的支原体核酸扩增检测（NAT）指南检测细胞培养物和细胞培养衍生材料中的支原体种类。该检测使用聚合酶链反应（PCR）扩增多种支原体特有的靶点。)

仪器、耗材

qPCR仪、超净工作台

实验步骤

1. 收集待测样本，如：细胞培养上清、培养基、血清、污染物表面擦拭液等。
注意：无需提取样品中的支原体基因组DNA。
2. 从冰箱取出检测试剂，室温融化，叩击混匀，离心机低速离心甩底。对于单个反应体系：准备 PCR 反应管,配制反应体系如下表：

组分	体积
荧光定量 PCR 扩增试剂（染料法）	10 ul
支原体鉴定引物	2 ul
样本	≤2 ul
无酶纯水	补至总体积 20 ul

3. 盖好管盖，叩击混匀，离心机低速离心甩底，至荧光定量 PCR 仪进行反应，参数如下：

 Applied Biosystem 7500 或 7900 (Life technologies)

95℃	30s	1 cycle
95℃	10s	40 cycles
60℃	34s	40 cycles

 StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Life technologies)

95℃	30s	1 cycle
95℃	10s	40 cycles
60℃	30s	40 cycles

 LightCycler® System (Roche Diagnostics)

95℃	30s	1 cycle
95℃	10s	40 cycles
60℃	30s	40 cycles
40℃	30s	1 cycle

4. 反应结束后，分析 Ct 值。

结果解释

根据对照和未知样本的Ct和Tm值分析支原体的存在。

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